- PCR (test) - što je PCR tehnika?
- PCR (test) - primjena PCR metode
- PCR (test) i lajmska bolest
- PCR - rezultati. Mogu li biti lažno pozitivni?
- PCR - rezultati. Mogu li biti lažno negativni
Pomozite razvoju web mjesta, dijelite članak s prijateljima!
PCR je test koji se koristi u dijagnostici mnogih bolesti. PCR metoda omogućuje dokazivanje izravne prisutnosti bakterija u organizmu, a točnije njezine DNK. PCR se koristi, između ostalog, u u dijagnostici lajmske bolesti. Što je PCR tehnika? Što je PCR u stvarnom vremenu?
Sadržaj:
- PCR (test) - što je PCR tehnika?
- PCR (test) - primjena PCR metode
- PCR (test) - lajmska bolest
- PCR (test) - rezultati. Mogu li biti lažno pozitivni?
- PCR (test) - rezultati. Mogu li biti lažno negativni
PCR(lančana reakcija polimeraze) je primarna metoda koja se koristi u genetskim i molekularnim laboratorijima. Razvila ga je 1983. Kara Mullis, koja je za to dobila Nobelovu nagradu 1993.
PCR (test) - što je PCR tehnika?
PCR testsastoji se od višestruke amplifikacije (obično u 30-40 ciklusa) specifičnog fragmenta DNA, npr. gena koji kodiraju proteine Borrelia, uz korištenje enzima polimeraze.
Zatim, kako bi se vizualizirao amplificirani fragment DNA, koriste se posebne molekularne boje. PCR je, zahvaljujući amplifikaciji specifičnih fragmenata DNK, ultraosjetljiva metoda.
U PCR metodi, fragmenti DNA se amplificiraju korištenjem specifičnih parova početnica za danu regiju bakterijske DNA. Na primjer, PCR ciljna područja koja se koriste u dijagnozi lajmske bolesti su geni koji kodiraju proteine, na pr. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
Biološki materijal iz kojeg se test može izvesti je:
- krv
- dio kože od migrirajućeg eritema
- cerebrospinalna tekućina
- sinovijalna ili hrskavična tekućina
- urin
PCR (test) - primjena PCR metode
Osim dijagnoze lajmske borelioze, PCR metoda može otkriti specifične fragmente DNK drugih mikroorganizama ili ljudi. Stoga se PCR metoda također koristi u:
- dijagnostika i praćenje virusnih infekcija: herpes virusi (herpes virus, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virusi hepatitisa (HBV i HCV)
- dijagnoza i praćenje bakterijskih infekcija, posebno onih bakterijskih,koji se ne mogu identificirati kroz kulture, npr. tuberkuloza
- dijagnoza i praćenje neoplastičnih bolesti: leukemija, rak dojke, kolorektalni rak, rak pluća
- dijagnoza predispozicije za rak: rak dojke i jajnika (BRCA1 i BRCA2 geni), kolorektalni karcinom (APC i CHEK2 geni)
- dijagnoza genetskih bolesti: hemokromatoza (HFE gen), talasemija (HBA1 i HBA2 geni), celijakija (HLA geni)
- testovi očinstva koji otkrivaju kompatibilnost DNK djeteta i oca
Trenutno postoje mnoge modifikacije PCR metode. Primjerice, u dijagnostici lajmske bolesti uglavnom se koriste metode ugniježđenog PCR-a (ugniježđeni PCR) i PCR u stvarnom vremenu ( ). Potonja je kvantitativna metoda i omogućuje određivanje točnog broja kopija DNK borelije u testiranom biološkom materijalu.
PCR (test) i lajmska bolest
Osnova za dijagnozu lajmske bolesti je serološko testiranje. Međutim, postoje kliničke situacije zbog kojih ovi testovi mogu biti lažno negativni:
- serološki prozor, tj. početno razdoblje infekcije u kojem tijelo još ne proizvodi specifična IgM i IgG antitijela protiv borelije
- kod imunokompromitiranih osoba koje ne proizvode dovoljno antitijela
- prisutnost imunoloških kompleksa koji se sastoje od antigena Borrelia i specifičnih antitijela za njih i sprječavaju otkrivanje antitijela serološkim metodama
Ako se sumnja da pacijent ima simptome lajmske bolesti, a rezultati seroloških testova su negativni, može se provesti molekularni test baziran na PCR metodi.
DNK Borrelia spiroheta može se otkriti u ranim fazama infekcije, budući da je broj spiroheta u tjelesnim tekućinama tada najveći.
U dijagnozi lajmske borelioze prvenstveno se koriste serološke metode kao što je ELISA, ali u nekim kliničkim situacijama pomaže genetsko testiranje pomoću PCR metode.
Što je duže vrijeme od infekcije, manja je vjerojatnost otkrivanja bakterijske DNK. Stoga se u nekim slučajevima, prije nego što se provede PCR test, bakterije uzgajaju na posebnim podlogama 1-2 tjedna, a zatim se vrši test.
Ovaj pristup se koristi u slučaju sumnje na lajmsku bolest i uzetu cerebrospinalnu tekućinu. U kasnoj fazi infekcije prikladnije je provesti ELISA test.
PCR metoda se ne smije koristiti u rutinskoj dijagnozi lajmske bolesti zbog nedostatka standardizacijeu vezi s pojavom sorti Borrelia burgdorferi u Poljskoj.
Međutim, u slučaju poteškoća u dijagnostici (osobito u ranoj fazi bolesti), rezultat PCR testa pomaže u dijagnostičkom procesu.
Pozitivan rezultat testa znači da je u testiranom materijalu otkrivena prisutnost DNK Borrelia burgdorferi i njegovih varijanti, ali ne objašnjava je li organizam aktivno zaražen. S druge strane, negativan rezultat ne isključuje prisutnost bakterija u tijelu.
Neki laboratoriji nude testiranje na prisutnost Borrelia DNK u krpelju. Međutim, rezultat takvog testa nije temelj za dijagnozu lajmske bolesti kod ugrizene osobe.
PCR - rezultati. Mogu li biti lažno pozitivni?
PCR je ultra-osjetljiva metoda i ujedno vrlo osjetljiva na kontaminaciju. Stoga je vrlo važno u testiranju temeljenom na PCR-u odabrati odgovarajuću internu kontrolu kako bi se isključili lažno pozitivni rezultati.
Ispravno prikupljanje materijala za testove, kao i iskustvo i pouzdanost dijagnostičara koji obavlja test također su od ključne važnosti.
PCR - rezultati. Mogu li biti lažno negativni
Kao iu svakom laboratorijskom testu, također iu PCR metodi, mogu se pojaviti lažno negativni rezultati. Ovdje je ključno prikupiti krv za odgovarajući antikoagulans, jer neki od njih, poput heparina, mogu inhibirati PCR reakciju.
Prikupljanje materijala nakon početka antibiotske terapije može smanjiti učinkovitost PCR reakcije i povećati vjerojatnost lažno negativnih rezultata.
Također treba imati na umu da bakterije Borrelia žive vrlo kratko u krvi i tjelesnim tekućinama, jer zahvaljujući posebnim receptorima vrlo brzo prodiru u "teško dostupna" mjesta u tijelu.
Stoga je, za razliku od dijagnostike drugih mikroorganizama, broj spiroheta Borrelia u biološkom materijalu mali, ponekad čak i na granici detekcije PCR metode. To također može uzrokovati lažno negativan rezultat.
Reference
- Dunaj J. i dr. Važnost PCR metode u dijagnostici Lyme borelioze. pretraživati Epidemiol. 2013., 67, 119 - 123.
- Laboratorijska dijagnostika bolesti koje se prenose krpeljima Preporuke Radne skupine: Nacionalna komora laboratorijskih dijagnostičara, Nacionalni institut za javno zdravstvo-Nacionalni higijenski institut, Nacionalni savjetnik za područje zaraznih bolesti, Zavod za zarazne bolesti i neuroinfekcije , Medicinsko sveučilište u Białystoku, Poljsko društvo za virusologiju, Varšava 2014.
- Ružić-Sabljić E. i Cerar T. Napredak u molekularnoj dijagnostici lajmske bolesti. Stručnjak Rev Mol Diag. 2022Siječanj; 17 (1): 19-30.
- Valones M.A.A. i dr. Principi i primjena lančane reakcije polimeraze u medicinskim dijagnostičkim područjima: pregled. Braz J Microbiol. 2009. siječanj-ožujak; 40 (1): 1-11.
Karolina Karabin, dr.med., molekularni biologinja, laboratorijska dijagnostičarka, Cambridge Diagnostics PolskaPo struci biolog, specijaliziran za mikrobiologiju, te laboratorijski dijagnostičar s preko 10 godina iskustva u laboratorijskom radu. Diplomirala je na Visokoj školi za molekularnu medicinu i članica Poljskog društva za humanu genetiku. Voditeljica stipendija za istraživanje u Laboratoriju za molekularnu dijagnostiku na Odjelu za hematologiju, onkologiju i unutarnje bolesti Medicinskog sveučilišta u Varšavi. Obranila je titulu doktorice medicinskih znanosti iz područja medicinske biologije na 1. Medicinskom fakultetu Medicinskog sveučilišta u Varšavi. Autor mnogih znanstvenih i popularno-znanstvenih radova iz područja laboratorijske dijagnostike, molekularne biologije i prehrane. Svakodnevno, kao specijalist iz područja laboratorijske dijagnostike, vodi odjel sadržaja u Cambridge Diagnostics Polska te surađuje s timom nutricionista u CD Dietary Clinic. Svoja praktična znanja o dijagnostici i dijetoterapiji bolesti dijeli sa specijalistima na konferencijama, treninzima te u časopisima i web stranicama. Posebno ju zanima utjecaj suvremenog načina života na molekularne procese u tijelu.